前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結(jié)構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。
本文件由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局提出。
本文件由全國屠宰加工標準化技術委員會（SAC/TC 516）歸口。
本文件起草單位：中國動物衛(wèi)生與流行病學中心、必維信諾（山東）檢測技術有限公司。
本文件主要起草人：王君瑋、王琳、鄧書、叢睿、趙格、邵緒卿、江翠蕓、高玉斌、宋時萍。
1 范圍
本文件規(guī)定了豬肉中卡拉膠檢測的制樣和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。
本文件適用于鮮、凍豬肉中卡拉膠的測定。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改）適用于本文件。
GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
3 術語和定義
本文件沒有需要界定的術語和定義。
4 原理
試樣經(jīng)鹽酸溶液處理后，其中的卡拉膠被降解生成特征性寡糖。用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測寡糖含量，外標法定量。
5 試劑和材料
除另有說明，所有試劑均為分析純。水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。
5.1 試劑
5.1.1 乙腈（CH3CN）：色譜純。
5.1.2 乙酸銨（CH3COCNH4）：色譜純。
5.1.3 濃鹽酸（HCI）：優(yōu)級純。
5.1.4 乙酸鋅［（CHH3COO）2Zn］。
5.1.5 亞鐵氰化鉀［K4Fe（CN）6·3H2O］。
5.2 標準品
卡拉膠（CAS號：9000-07-1），純度≥99%。
5.3 材料
5.3.1 濾膜：水相，0.22μm。
5.3.2 濾膜：有機相，0.22μm。
5.4 溶液配制
5.4.1 0.005mol/L乙酸銨水溶液：稱取乙酸銨0. 39g，用水溶解并定容至1000mL，過0.22μm水相濾膜。
5.4.2 190g/L乙酸鋅溶液：稱取乙酸鋅19g，用水溶解并定容至100ml。
5.4.3 150g/L亞鐵氰化鉀溶液：稱取亞鐵氰化鉀15g，用水溶解并定容至100mI。
5.4.4 標準儲備液（1000mg/L）：稱取卡拉膠對照品0.010 0g，加入適量水，60℃恒溫水浴溶解。冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶用水定容至刻度，即為1000mg/L儲備液。臨用現(xiàn)配。
6 儀器設備
6.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子（ESI）源。
6.2 分析天平：感量為0.000 1g和感量為0.01g。
6.3 低溫高速離心機：轉(zhuǎn)速≥8000r/min。
6.4 渦旋混合器。
6.5 組織搗碎機。
6.6 勻漿機。
6.7 恒溫振蕩水浴鍋。
7 試樣制備與保存
7.1 試樣的制備
取適量新鮮或解凍的空白或供試組織，用組織搗碎機絞碎并均質(zhì)：
——取均質(zhì)的供試樣品，作為供試試樣；
——取均質(zhì)的空白樣品，作為空白試樣。
7.2 試樣的保存
在-20℃以下保存。
8 試樣處理
稱取5g（精確至0.01g）試樣于50mL離心管中。加入20mL水，于4℃10 000r/min勻漿1min。加入2ml濃鹽酸，渦旋30s，置于80℃恒溫振蕩水浴鍋振蕩2h，取出后冷卻至室溫。依次加入1.5mL190g/L的乙酸鋅溶液、1.5mL150g/L的亞鐵氰化鉀溶液，渦旋1min沉淀蛋白質(zhì)。于4℃8 000r/min離心5min，取上清液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，用乙腈定容，過0.22μm有機相濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。
9 測定
9.1 液相色譜參考條件
9.1.1 色譜柱：BEH Amide柱（1.7μm，2.1mm× 100mm），或相當者。
9.1.2 進樣量：1μL。
9.1.3 柱溫：30℃。
9.1.4 流速：0.4mL/min。
9.1.5 流動相：A相：0.005mol/L乙酸銨水溶液；B相：乙腈。梯度洗脫程序見表1。
表1 梯度洗脫程序
| 時間 min | A相 % | B相 % |
| 0.00 | 50 | 50 |
| 2.00 | 50 | 50 |
| 2.01 | 25 | 75 |
| 4.00 | 25 | 75 |
| 4.01 | 50 | 50 |
| 6.00 | 50 | 50 |
9.2 質(zhì)譜參考條件
9.2.1 離子源：電噴霧電離源（ESI）。
9.2.2 參考質(zhì)譜條件如下：
a）檢測方式：多反應檢測（MRM）；
b）掃描模式：負離子掃描；
c）毛細管電壓：-2.5kV（ESI- ）；
d）干燥氣溫度：325℃；
e）干燥氣流量：8L/min；
f）霧化氣壓力：40psi；
g）鞘氣溫度：350℃；
h）鞘氣流量：10L/mi；
i）多反應監(jiān)測條件見表2。
表2 卡拉膠降解產(chǎn)物的質(zhì)譜參數(shù)
| 被測物名稱 | 定量離子對 m/z | 定性離子對 m/z | 碎裂電壓 V | 碰撞能量 eV |
| 特征性寡糖 | 403.0＞97.0 | 403.0＞241.0 | 190 | 34 |
| 403.0＞97.0 | 190 | 46 |
9.3 標準曲線的制作
取5個50mL離心管，分別準確加入1 000mg/L標準儲備液50μL、100μL、250μL、500μL、1 000μL。然后加入23mL，水，再加入2mL濃鹽酸，加蓋后在渦旋混合器渦旋30s，置于80℃恒溫振蕩水浴鍋振蕩2h。取出后冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用乙腈定容，過0.22μm有機相濾膜，分別注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，即為1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L工作液。以卡拉膠標準工作液濃度為橫坐標、定量離子的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。
9.4 定性測定
通過試樣色譜圖的保留時間與相應標準溶液的保留時間、色譜峰的特征離子與相應濃度標準溶液色譜峰的特征離子相對照定性。試樣與標準溶液保留時間的相對偏差不大于5%。試樣特征離子的相對豐度與濃度相當標準溶液的相對豐度一致，相對豐度偏差不超過表3的規(guī)定，則可判斷試樣中存在相應的被測物。
表3 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差 單位為百分號
| 相對離子豐度 | ＞50 | 20～50 | 10～20 | ≤10 |
| 允許的最大偏差 | ±20 | ±25 | ±30 | ±50 |
9.5 定量測定
取試樣溶液和標準溶液，按外標法。以峰面積定量。標準溶液及試樣溶液中的卡拉膠降解產(chǎn)物特征性寡糖響應值均應在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。在上述色譜質(zhì)譜條件下，卡拉膠降解產(chǎn)物特征性寡糖的特征離子質(zhì)量色譜圖見附錄A。
9.6 空白試驗
除不加試樣外，采用完全相同的測定步驟進行測定。
10 結(jié)果計算
結(jié)果按公式（1）計算。
....................................（1） 式中：
X--試樣中卡拉膠的含量數(shù)值，單位為毫克每千克（mg/kg）；
C--由標準曲線計算出的樣品溶液中卡拉膠的濃度數(shù)值，單位為毫克每升（mg/L）；
V--試樣溶液定容體積數(shù)值，單位為毫升（mL）；
M--試樣稱樣量數(shù)值，單位為克（g）。
計算結(jié)果須扣除空白值。測定結(jié)果用平行測定的算術平均值表示，結(jié)果保留3位有效數(shù)字。
11 檢測方法靈敏度、準確度和精密度
11.1 靈敏度
本方法的檢測限為3mg/kg，定量限為10mg/kg。
11.2 準確度
本方法在10mg/kg～100mg/kg添加濃度水平上的回收率為70%～100%。
11.3 精密度
在重復性條件下獲得的2次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。
附錄A 卡拉膠降解物特征離子質(zhì)量色譜圖 （略）
本標準由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2021年5月7日發(fā)布，2021年11月1日實施。
