摘要：以豬背最長(zhǎng)肌為原料，研究超高壓（100～600MPa）結(jié)合熱處理（25～55℃）條件下，蛋白質(zhì)相互作用力的變化，豬肉主要組成部分肌原纖維蛋白氧化程度，表面疏水性及結(jié)構(gòu)變化，并建立他們之間的相關(guān)性。研究結(jié)果表明：超高壓結(jié)合熱處理后穩(wěn)定豬肉蛋白質(zhì)的作用力主要是氫鍵、疏水性相互作用和二硫鍵。經(jīng)超高壓結(jié)合熱處理的肌原纖維蛋白質(zhì)巰基含量極顯著下降（p＜0.01），二硫鍵含量、疏水性和羰基值極顯著上升（p＜0.01）。二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，螺旋結(jié)構(gòu)減少，無(wú)序結(jié)構(gòu)增多。相關(guān)性分析結(jié)果表明超高壓結(jié)合熱處理與蛋白質(zhì)相互作用力、蛋白質(zhì)羰基值、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間存在著極顯著的相關(guān)關(guān)系（p＜0.01）。這些結(jié)果可以幫助我們?nèi)嬲J(rèn)識(shí)超高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中蛋白質(zhì)的變化，科學(xué)指導(dǎo)其生產(chǎn)過(guò)程，為開(kāi)發(fā)新型肉制品提供理論依據(jù)。

　　關(guān)鍵詞：超高壓；熱處理；蛋白質(zhì)相互作用力；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；相關(guān)分析

　　食品超高壓技術(shù)能在不影響肉類(lèi)風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)成分的前提下改善肉類(lèi)嫩度，延長(zhǎng)貨架期，同時(shí)保持原有的色、香、味、形，但同時(shí)超高壓處理也能促進(jìn)肉中脂肪氧化，這也限制了其在肉制品中的應(yīng)用。大量研究表明，對(duì)僵直前期的肌肉進(jìn)行壓力處理能取得較好的嫩化效果，而僵直后肌肉則需與一定的熱處理相結(jié)合。因此，高壓技術(shù)在肉類(lèi)加工中的應(yīng)用正朝著與熱結(jié)合處理的方向發(fā)展。我國(guó)超高壓技術(shù)的研究明顯落后于發(fā)達(dá)國(guó)家，尤其是日本、美國(guó)和韓國(guó)等，迫切需要加快開(kāi)展超高壓食品的研究。

　　蛋白質(zhì)是肉制品的主要組成部分之一，肌原纖維蛋白約占總蛋白的40%～60%，不但在肌肉收縮中很重要，而且在肉類(lèi)加工中起關(guān)鍵作用，它與肉制品加熱過(guò)程中形成的粘結(jié)性和質(zhì)構(gòu)有關(guān)，還賦予肌肉食品許多期望的物理化學(xué)特性，具有重要的生物學(xué)功能特性，對(duì)食品感官品質(zhì)具有重要的影響。超高壓結(jié)合熱處理會(huì)改變蛋白質(zhì)相互作用力及結(jié)構(gòu)，使其功能特性發(fā)生變化，如蛋白質(zhì)的溶解性、凝膠型及乳化活性等，從而影響實(shí)際生產(chǎn)中蛋白質(zhì)的加工特性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。只有了解超高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化機(jī)制，才能更好地在實(shí)際生產(chǎn)中進(jìn)行規(guī)模化應(yīng)用。

　　近年來(lái)，高壓對(duì)蛋白質(zhì)的影響逐漸成為食品工作者研究的熱點(diǎn)，在高壓條件下蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化是高壓技術(shù)在食品中應(yīng)用的基礎(chǔ)。目前，相關(guān)研究主要集中在肌原纖維蛋白及其主要成分肌球蛋白的熱誘導(dǎo)凝膠特性和單純高壓處理對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及凝膠特性的影響。國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)超高壓結(jié)合熱處理對(duì)豬肉蛋白質(zhì)相互作用力及結(jié)構(gòu)影響的報(bào)道。本研究以豬背最長(zhǎng)肌為原料，對(duì)其進(jìn)行超高壓（100～600MPa）結(jié)合熱（25～55℃）處理15min，利用不同溶劑對(duì)不同蛋白質(zhì)作用力的規(guī)避作用研究蛋白質(zhì)相互作用力的變化，評(píng)價(jià)豬肉主要組成部分肌原纖維蛋白氧化程度，跟蹤其表面疏水性及結(jié)構(gòu)的變化，并分析他們之間的相關(guān)性，以期全面認(rèn)識(shí)超高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中蛋白質(zhì)的變化，加快超高壓食品的研究，科學(xué)指導(dǎo)其生產(chǎn)過(guò)程，為開(kāi)發(fā)新型肉制品提供理論依據(jù)。

　　白玉黑土豬  四川綿陽(yáng)天農(nóng)生態(tài)食品開(kāi)發(fā)有限公司提供，為同批飼養(yǎng)，宰殺后冷卻，取背最長(zhǎng)肌約1kg，快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，剔除肉眼可見(jiàn)脂肪及結(jié)締組織等，按20g/份分裝于真空透明封裝袋中，于真空封裝機(jī)上真空包裝，-18℃保藏待用。原料肉使用前需在4℃下解凍24h。

　　苯甲基磺酰氟；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、EDTA、三氯乙酸（TCA）、氯化鈉、尿素、溴酚藍(lán)、乙酸、十二烷基磺酸鈉（SDS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、β-巰基乙醇、丙酮、乙酸乙酯、鹽酸胍及其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純。

　　HPP.L2-800/1型食品高壓設(shè)備；DZ400-DZ（2L）型真空封裝機(jī)；FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)；UV1000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；CR22GⅢ高速冷凍離心機(jī) HITACHI；FT-IR5700 傅里葉變換紅外光譜儀。

　　超高壓結(jié)合熱處理參數(shù)設(shè)置為：最高工作壓力為800MPa，升壓速度約50MPa/s，卸壓速度約100MPa/s。傳壓介質(zhì)為葵二酸二辛酯液壓油，將真空封裝且解凍后的樣品，對(duì)其進(jìn)行超高壓（100～600MPa）結(jié)合熱處理（25～55℃）15min。處理后備用。

　　豬肉蛋白質(zhì)分子相互作用力的測(cè)定參照Visessanguan 等方法，并略加改進(jìn)。溶液包括：0.6mol/L KCl (S1)；20mmol/L Tris，pH8.0 (S2)；20mmol/LTris，pH8.0包含1% (m/V) SDS (S3)；20mmol/L Tris，pH8.0包含1% (m/V) SDS 和8mol/L 尿素(S4)；20mmol/L Tris，pH8.0包含1% (m/V) SDS，8mol/L 尿素和2% (V/V)β-巰基乙醇(S5)；0.5 mol/L NaOH(S6)。2g絞碎樣品，分別加入20mL上述溶液，室溫下磁力攪拌4h，其S5攪拌前100℃水浴2min。樣品在離心機(jī)中以12100×g離心30min，將4mL上清液加入50% TCA使上清液最終TCA濃度達(dá)到10%，樣品在3℃冷藏18h，之后在離心機(jī)中以2500×g離心20min，沉淀用0.5mol/L NaOH 溶解，蛋白質(zhì)含量采用雙縮脲法測(cè)定。結(jié)果以各部分蛋白含量占S6的百分比表示。

　　采用Martinaud 等方法并略加改進(jìn)。10g絞碎樣品，加入10倍溶液(20mmol/L磷酸鹽緩沖溶液，pH6.5，含50mmol/L NaCl，25mmol/L KCl，3 mmol/LMgCl2，4 mmol/L EDTA，1mmol/L PMSF)，用高速勻漿機(jī)在8000r/min 冰浴下均質(zhì)1min，勻漿過(guò)60目篩網(wǎng)去除基質(zhì)蛋白，濾過(guò)液在冷凍離心機(jī)中離心(2000×g，15min，4℃)，沉淀部分用50mmol/L KCl(pH6.4)磷酸鹽緩沖液洗滌一次和去離子水洗滌兩次。得到沉淀即為肌原纖維蛋白。部分樣品冷凍干燥備紅外光譜檢測(cè)。

　　參照Beveridge 等的Ellman 試劑分析方法略加改進(jìn)。加4mg DTNB 試劑于1mL的Tris-甘氨酸緩沖液(0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，4 mmol/LEDTA，pH8.0)中，配成Ellman 試劑。將提取的肌原纖維蛋白加入5倍體積的緩沖溶液勻漿，取0.5mL勻漿液溶于2.5 mL的Tris-甘氨酸-8mol/L尿素緩沖液，漩渦震蕩，加入20μL Ellman 試劑，將懸濁液置于室溫(25℃±1℃)下保溫1h，10000×g離心15min，測(cè)定412nm處吸光值(A412)，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，280nm測(cè)定相應(yīng)蛋白質(zhì)含量。計(jì)算公式如下：

　　μmol SH/g=73.53A412/C

　　其中73.53=106/1.36×104，1.36×104為摩爾消光系數(shù)，C 為樣品的蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。

　　測(cè)定總巰基含量時(shí)，取0.2 mL勻漿液，加入2mLTris-甘氨酸-10mol/L尿素緩沖液，再加入0.02 mL β-巰基乙醇，室溫下反應(yīng)1h，之后加入50%TCA至最終濃度為10%，3000×g離心沉淀用12%TCA 洗滌兩次，將沉淀溶于3mL的Tris-甘氨酸-8mol/L 尿素緩沖液，二硫鍵含量為總巰基含量與游離巰基的差值。

　　蛋白質(zhì)的氧化采用羰基值表征。測(cè)定方法按照Oliver等方法。

　　肌原纖維蛋白用20mM的磷酸緩沖溶液分散，用雙縮脲法調(diào)整蛋白濃度為10mg/mL。表面疏水性測(cè)定采用Chelh等方法并略加改進(jìn)，1mL懸濁液加入40μL 1mg/mL的溴酚藍(lán)溶液，渦旋振蕩混勻10min?？瞻诪橛?0mM的磷酸緩沖溶液代替蛋白溶液。在離心機(jī)中以2000×g離心15 min，595nm測(cè)定吸光值。表面疏水性按下述公式計(jì)算：

　　BPB bound(μg)=40μL×(OD control-OD sample)/OD control

　　1.4.4  肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

　　采用傅里葉紅外變換光譜(FT-IR)分析肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。準(zhǔn)確稱(chēng)量2mg的樣品，加入100mg溴化鉀，用研缽研磨成均勻粉末，壓制成薄片，再用紅外光譜儀做全波段掃描(400～4000 cm-1)，掃描次數(shù)128次。數(shù)據(jù)處理采用PeakFit 4.12軟件，Omnic 軟件和Origin8.0軟件。

　　每組試驗(yàn)重復(fù)4次，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）給出，采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（p＜0.01）。

　　影響蛋白質(zhì)折疊的作用力主要可以分為兩類(lèi)：蛋白質(zhì)分子固有作用力所形成的分子內(nèi)相互作用；受周?chē)軇┯绊懙姆肿觾?nèi)相互作用。范德華相互作用和空間相互作用屬于前者，而氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用屬于后者。在超高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中，豬肉蛋白質(zhì)分子間相互作用力會(huì)發(fā)生改變，進(jìn)而影響其品質(zhì)和加工性能。

　　本研究采用五種不同的溶劑規(guī)避不同的蛋白質(zhì)作用力，氯化鉀規(guī)避靜電作用力，SDS規(guī)避氫鍵，尿素規(guī)避疏水作用力，巰基乙醇打破二硫鍵。圖1（a～e）顯示了豬肉經(jīng)超高壓（100～600 MPa）結(jié)合熱處理（25～55℃）后，蛋白質(zhì)在不同溶劑（S1～S5）中溶解度的變化，進(jìn)而反映出不同的蛋白質(zhì)分子相互作用力在超高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中的變化規(guī)律，從而得出其對(duì)三維結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)。

　　隨著處理壓力和溫度的升高，蛋白質(zhì)在S1中的溶解度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，主要是由于熱作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和蛋白質(zhì)降解所造成的蛋白質(zhì)部分損失。增加處理壓力，蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用被削弱，符合勒夏特列原理，即超高壓會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)分子內(nèi)的離子鍵斷裂。S2的變化規(guī)律與S1類(lèi)似，超高壓和熱處理會(huì)造成蛋白質(zhì)多肽鏈伸展和去折疊從而形成一些網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和聚集，影響蛋白質(zhì)在S2中的溶解度。在25℃下，隨著壓力的增大，蛋白質(zhì)在S3中的溶解度變化并不明顯。溫度進(jìn)一步升高到35℃，在不同的壓力處理?xiàng)l件下，溶解度略有下降。溫度繼續(xù)從35℃增加到55℃，常壓下溶解度明顯變化（從63.90%下降到55.93%），然后隨著壓力的上升，又逐步回升。原因可能在于，溫度從35℃增加到55℃，蛋白質(zhì)在熱作用下二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，氫鍵急劇減少；然而超高壓處理可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子間的氫鍵，Le Tilly 等人對(duì)馬心肌肌紅蛋白進(jìn)行了紅外光譜分析，發(fā)現(xiàn)300MPa的壓力對(duì)分子內(nèi)部的氫鍵有穩(wěn)定作用。隨著壓力的升高，蛋白質(zhì)形成新的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，相應(yīng)的氫鍵作用力又緩慢回升。溫度從25℃升到35℃，常壓下蛋白質(zhì)在S4中的溶解度減小，溫度進(jìn)一步升高到55℃，溶解度達(dá)到最大值。然后隨壓力的增大而逐步回落。蛋白質(zhì)溶液系統(tǒng)中的熵增加是疏水作用的主要推動(dòng)力。從35℃到55℃，熱作用使得蛋白質(zhì)溶液變性展開(kāi)，疏水基團(tuán)更加暴露，疏水相互作用力也快速升高。這時(shí)增加處理壓力，蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)逐步形成和加強(qiáng)，疏水基團(tuán)被不斷固定，因此疏水相互作用力穩(wěn)步下降。Grigera 等人研究發(fā)現(xiàn)，300MPa的壓力降低了脫輔基肌紅蛋白的疏水作用，引起該蛋白分子三維結(jié)構(gòu)的改變。蛋白質(zhì)在S5中的溶解度隨著壓力和溫度的升高而增大，55℃600MPa達(dá)到最大值。這是因?yàn)椋S著壓力和溫度的增加，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，暴露的巰基通過(guò)二硫鍵形成聚集。

　　綜上所述，超高壓結(jié)合熱處理后穩(wěn)定豬肉蛋白質(zhì)的作用力主要是氫鍵、疏水性相互作用和二硫鍵。未處理豬肉在S1-S5溶劑中溶解度從大至小分別為S3＞S4＞S5＞S2＞S1，說(shuō)明此時(shí)靜電作用、氫鍵、疏水作用和二硫鍵均對(duì)蛋白三維結(jié)構(gòu)有貢獻(xiàn)，而超高壓結(jié)合熱處理后，改變了這幾種作用力的貢獻(xiàn)大小，使得溶解度大小變化為S5＞S3＞S4＞S2＞S1，表明在超高壓結(jié)合熱處理的過(guò)程中，蛋白質(zhì)降解會(huì)導(dǎo)致肉蛋白中巰基的暴露，加快二硫鍵的形成，而二硫鍵對(duì)于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起著重要作用。

　　2.2  超高壓結(jié)合熱處理對(duì)豬肉肌原纖維蛋白巰基和二硫鍵的影響

　


　
圖1 超高壓結(jié)合熱處理對(duì)蛋白質(zhì)相互作用力的影響

　　注：a～e分別代表不同溫度和壓力處理?xiàng)l件下，蛋白質(zhì)在溶劑S1～S5中的溶解性。

　　天然蛋白質(zhì)中包埋有許多疏水基團(tuán)和疏基，圖2為超高壓結(jié)合熱處理?xiàng)l件下豬肉肌原纖維蛋白疏基和二硫鍵含量的變化情況。從圖中可以看出，隨著壓力和溫度的上升，巰基含量極顯著下降（p＜0.01），二硫鍵含量極顯著上升（p＜0.01）。這表明超高壓和熱處理下巰基基團(tuán)暴露到分子表面，部分與空氣中的氧氣充分結(jié)合，形成二硫鍵，與2.1中超高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中二硫鍵對(duì)于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起著重要作用結(jié)果一致。二硫鍵是穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要化學(xué)鍵，二硫鍵的生成可以降低蛋白質(zhì)的構(gòu)象熵，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得穩(wěn)定從而達(dá)到良好的熱穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)也更為致密，凝膠強(qiáng)度增加。因此，肉制品超高壓處理應(yīng)充分考慮壓力和溫度對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響。

　　2.3  超高壓結(jié)合熱處理對(duì)豬肉肌原纖維蛋白疏水性的影響

　　肌原纖維蛋白質(zhì)屬于水不溶性蛋白，不能采用ANS熒光探針?lè)y(cè)定，Chelh利用疏水性基團(tuán)與溴酚藍(lán)結(jié)合創(chuàng)建了肌原纖維蛋白質(zhì)表面疏水性的測(cè)定方法。疏水作用是維持蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的主導(dǎo)作用力之一，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和功能性質(zhì)具有重要作用。蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是蛋白分子之間以及蛋白分子與溶劑水分子之間作用力平衡的結(jié)果。一定的疏水性對(duì)于蛋白凝膠的形成和產(chǎn)生穩(wěn)定的乳化物非常重要。

　　






圖2 超高壓結(jié)合熱處理對(duì)巰基和二硫鍵的影響

　　注：相同指標(biāo)標(biāo)注不同字母者具有極顯著性差異，p＜0.01；a～d 分別代表25℃、35℃、45℃和55℃溫度處理?xiàng)l件下，巰基和二硫鍵含量對(duì)壓力增加的變化規(guī)律。

　　
圖3 超高壓結(jié)合熱處理對(duì)豬肉肌原纖維蛋白疏水性的影響

　　注：同一條曲線(xiàn)標(biāo)注不同字母者具有極顯著性差異，p＜0.01。

　　從圖3可以看出，隨著壓力和溫度增加，豬肉肌原纖維蛋白疏水性逐漸增加，當(dāng)壓力大于200MPa時(shí)，疏水性極顯著增大（p＜0.01）。壓力會(huì)導(dǎo)致肌原纖維蛋白解折疊，從而使疏水殘基從蛋白質(zhì)內(nèi)部暴露出來(lái)，同時(shí)，壓力還會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表面特殊氨基酸殘基的出現(xiàn)，導(dǎo)致疏水性增加。熱作用也會(huì)導(dǎo)致表面疏水性的極顯著增加（p＜0.01）。Chelh 等研究結(jié)果表明肌原纖維蛋白的表面疏水性與加熱時(shí)間和溫度顯著相關(guān)。

　　2.4  超高壓結(jié)合熱處理對(duì)豬肉肌原纖維蛋白氧化的影響

　　

圖4 超高壓結(jié)合熱處理對(duì)豬肉肌原纖維蛋白羰基值的影響

　　注：同一條曲線(xiàn)標(biāo)注不同字母具有極顯著性差異，p＜0.01。

　　超高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中豬肉肌原纖維蛋白羰基值的變化如圖4所示。隨著壓力和溫度的升高，羰基值極顯著增大（p＜0.01），從25℃0.1 MPa時(shí)的1.432nmol/mg 蛋白增加到55℃600 MPa時(shí)的9.965nmol/mg 蛋白。Sato和Hegaryt認(rèn)為，任何能引起肉類(lèi)肌纖維膜系統(tǒng)破壞的處理過(guò)程，如絞碎、加熱、高壓等，都能導(dǎo)致易氧化的成分曝露于氧氣中，從而加速氧化過(guò)程。在高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白及大部分肌漿蛋白變性，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，造成鐵及其它過(guò)渡金屬離子的釋放，一些亞鐵血紅素、過(guò)渡態(tài)的金屬離子和各種氧化酶可能會(huì)作為產(chǎn)生活性氧(ROS)和非氧自由基的催化劑或者作為前體物質(zhì)。這些自由基會(huì)攻擊蛋白質(zhì)，對(duì)蛋白質(zhì)氧化起到很強(qiáng)的催化作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)羰基值升高。Estévez 等研究發(fā)現(xiàn)在法蘭克福香腸冷藏過(guò)程中蛋白質(zhì)羰基值與脂質(zhì)氧化的羰基值顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.75(p＜0.01)。豬肉在超高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中脂質(zhì)氧化程度增加，這可能是造成蛋白質(zhì)氧化的原因之一。

　　2.5  超高壓結(jié)合熱處理對(duì)豬肉肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

　　酞胺Ⅰ帶的特征吸收峰位于1700cm-1-1600cm-1，是由蛋白多肽骨架的C=O 伸縮振動(dòng)引起的，為蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的敏感區(qū)域，且其吸收最強(qiáng)，常被用于蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

　　超高壓結(jié)合熱處理后肌原纖維蛋白紅外光譜圖進(jìn)行基線(xiàn)校正和9點(diǎn)平滑后，發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白酰胺Ⅰ帶是由多個(gè)氨基酸殘基經(jīng)重疊形成的寬峰，因此，需對(duì)各樣品的酰胺Ⅰ譜帶（1700～1600 cm-1）用軟件進(jìn)行求二階導(dǎo)數(shù)及去卷積，對(duì)得到的各子峰進(jìn)行確認(rèn)，經(jīng)Peakfit 對(duì)曲線(xiàn)進(jìn)行擬合，多次擬合使殘差最小。根據(jù)峰面積計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)的比率。各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)關(guān)系為：1600～1640 cm-1 為β-折疊；1640～1650cm-1為無(wú)規(guī)卷曲；1650～1660 cm-1為α-螺旋；1660～1695cm-1 為β-轉(zhuǎn)角。

　　







圖5 超高壓結(jié)合熱處理后豬肉肌原纖維蛋白紅外圖譜

　　超高壓結(jié)合熱處理?xiàng)l件下，豬肉肌原纖維蛋白紅外原始圖譜如圖5所示，由上到下依次為25～55℃。隨著處理壓力和溫度的增加，肌原纖維蛋白氨基酸殘基總吸光度發(fā)生了變化，峰形發(fā)生了不同程度的改變，說(shuō)明蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。25℃下，隨著壓力的增大，酰胺Ⅰ帶的吸收峰由1656 cm-1 移動(dòng)到1650cm-1；35℃下，增大壓力，酰胺Ⅰ帶的吸收峰由1655cm-1 升高到1656 cm-1 最后又降低到1648cm-1 此處是無(wú)規(guī)卷曲的特征吸收峰；45℃下，隨著壓力的升高，酰胺Ⅰ帶的吸收峰由1647cm-1向高波數(shù)移動(dòng)到1657cm-1，此處是α螺旋的特征吸收峰；55℃下，酰胺Ⅰ帶的吸收峰由1648cm-1 移動(dòng)到1639cm-1，此處是β折疊的特征吸收峰，隨后又隨著壓力的增大移動(dòng)到1648cm-1。同樣，隨著溫度的不斷升高，酰胺Ⅰ帶的吸收峰也發(fā)生了不同程度的位移。

　　為了將肌原纖維蛋白酰胺Ⅰ帶的差異放大，提高光譜的分辨率，對(duì)其進(jìn)行了二階導(dǎo)數(shù)求導(dǎo)，重疊峰和小肩峰被明顯分離，總峰數(shù)在9～12個(gè)之間，符合處理規(guī)則。觀察各種處理的每個(gè)峰帶，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有明顯的變化。波數(shù)出現(xiàn)紅移或者藍(lán)移，或者出現(xiàn)新峰。

　　表1 超高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量（%）變化

　　注：同列中同一溫度標(biāo)注不同字母者具有極顯著性差異，p＜0.01。

　　曲線(xiàn)擬合結(jié)果如表1所示，未處理肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)主要以β折疊為主，占38.58%，其他三類(lèi)分別為α螺旋15.85%，β轉(zhuǎn)角29.89%和無(wú)規(guī)卷曲15.69%。胡飛華采用傅里葉紅外光譜分析超高壓對(duì)梅魚(yú)魚(yú)糜肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是以β 折疊為主。25℃下，隨著處理壓力的升高，β折疊含量極顯著下降（p＜0.01），無(wú)規(guī)卷曲含量極顯著上升（p＜0.01）。α螺旋在600MPa 時(shí)極顯著增大（p＜0.01），β轉(zhuǎn)角隨著處理壓力的增加逐漸增大，400 MPa 達(dá)到最大值，隨后極顯著降低（p＜0.01）。35℃時(shí)，β折疊與無(wú)規(guī)卷曲含量變化與25℃相似，α螺旋未發(fā)生明顯變化，β轉(zhuǎn)角也呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì)。45℃處理下，隨著壓力的增大，β折疊極顯著降低（p＜0.01），無(wú)規(guī)卷曲和α螺旋含量緩慢增大，β轉(zhuǎn)角含量極顯著上升（p＜0.01），由26.23%增加到30.79%。55℃下，β折疊和α螺旋含量下降，分別由44.72%和14.76%下降到29.88%和13.31%，無(wú)規(guī)卷曲和β轉(zhuǎn)角含量極顯著上升（p＜0.01），分別由由19.17%和21.36%上升到24.92%和31.85%。此時(shí)，豬肉肌原纖維蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，螺旋結(jié)構(gòu)減少，無(wú)序結(jié)構(gòu)增多，疏水結(jié)合和離子結(jié)合可能由于體積的減小被切斷，分子鏈展開(kāi)。同時(shí)，對(duì)比不同溫度處理下，β折疊和α螺旋的含量不難發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，β折疊含量逐漸升高，α螺旋含量逐漸降低，說(shuō)明加熱促進(jìn)肌原纖維蛋白的α螺旋向β折疊轉(zhuǎn)換。α螺旋結(jié)構(gòu)是通過(guò)分子內(nèi)氫鍵維持的蛋白質(zhì)分子內(nèi)的有序排列。在加熱條件下其含量降低說(shuō)明加熱導(dǎo)致維持α螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵作用減弱，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子展開(kāi)；β折疊是通過(guò)分子間氫鍵維持的蛋白質(zhì)分子間的有序排列，加熱后其含量增加代表蛋白質(zhì)分子間氫鍵作用增強(qiáng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間聚集程度增大。

　　2.6 相關(guān)性分析

　　表2 超高壓和熱處理與蛋白質(zhì)相互作用力、蛋白質(zhì)氧化、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性

　　注：*顯著相關(guān)(P＜ 0.05)；**極顯著相關(guān)(p＜0.01)。

　　由表2可知，溫度與氫鍵和巰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01），與二硫鍵、疏水性、羰基值呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01），與α螺旋呈顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.05），說(shuō)明加熱破壞了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，使氫鍵減小，蛋白質(zhì)氧化，促進(jìn)巰基與二硫鍵二者之間的轉(zhuǎn)換，使疏水性上升，同時(shí)，破壞了分子內(nèi)的有序排列，使蛋白質(zhì)分子展開(kāi)程度增加。壓力與氫鍵、二硫鍵、疏水性、羰基值呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01），與靜電相互作用、疏水相互作用、巰基、β折疊呈極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01），與無(wú)規(guī)卷曲呈顯著正相關(guān)（p＜0.05），說(shuō)明與熱處理相反的是壓力可以穩(wěn)定氫鍵，使巰基轉(zhuǎn)換成二硫鍵，疏水性增大，羰基值增加，蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，靜電相互作用和疏水相互作用在壓力的作用下被削弱，蛋白質(zhì)有序結(jié)構(gòu)減少，無(wú)序結(jié)構(gòu)增多。還可以發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)羰基值與靜電相互作用和巰基呈極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01），相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.876 和0.951，與二硫鍵和疏水性呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01），相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.951和0.902，說(shuō)明蛋白質(zhì)氧化可以引起聚集和表面疏水性的變化，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。靜電相互作用力與β折疊呈極顯著正相關(guān)與無(wú)規(guī)卷曲呈極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01），氫鍵與β折疊呈極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01），疏水相互作用力與β折疊呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01），與無(wú)規(guī)卷曲呈顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.05），說(shuō)明隨著蛋白質(zhì)有序結(jié)構(gòu)向無(wú)序結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，靜電相互作用和疏水相互作用力被削弱，氫鍵由于蛋白質(zhì)的展開(kāi)聚集和體積減小被加強(qiáng)。

　　在超高壓結(jié)合熱處理豬肉過(guò)程中，隨著壓力和溫度的升高，肌原纖維蛋白巰基含量極顯著下降（p＜0.01），二硫鍵含量極顯著上升（p＜0.01），疏水性和羰基值都極顯著增大（p＜0.01），高壓結(jié)合熱處理后穩(wěn)定豬肉蛋白質(zhì)的作用力主要是氫鍵、疏水性相互作用和二硫鍵。豬肉肌原纖維蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)在高壓結(jié)合熱處理過(guò)程中發(fā)生重排，螺旋結(jié)構(gòu)減少，無(wú)序結(jié)構(gòu)增多。從相關(guān)性分析的結(jié)果看，超高壓結(jié)合熱處理與蛋白質(zhì)相互作用力、蛋白質(zhì)羰基值、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間存在著極顯著的相關(guān)關(guān)系（p＜0.01）。同時(shí)，蛋白質(zhì)羰基值與靜電相互作用和巰基呈極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01 ），與二硫鍵和疏水性呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01），說(shuō)明蛋白質(zhì)氧化可以引起聚集和表面疏水性的變化，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。靜電相互作用力和疏水相互作用力與β折疊呈極顯著正相關(guān)與無(wú)規(guī)卷曲呈極顯著和顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01）（p＜0.05），氫鍵與β折疊呈極顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.01），說(shuō)明隨著蛋白質(zhì)有序結(jié)構(gòu)向無(wú)序結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，靜電相互作用和疏水相互作用力被削弱，氫鍵由于蛋白質(zhì)的展開(kāi)聚集和體積減小被加強(qiáng)。