摘要：以新鮮牛肉為原料，分析不同濃度的Curdlan 及Alcalase對生鮮調理牛肉剪切力、蒸煮損失及感官品質的影響，并研究該體系下肌漿蛋白質及肌原纖維蛋白質的分解情況，優(yōu)化生鮮調理牛肉嫩化加工工藝。結果表明: 體系中Curdlan對生鮮調理牛肉剪切力、蒸煮損失及感官品質均有顯著的影響(P＜0.05) ，但是對牛肉中蛋白質無明顯的分解作用;Alcalase 對肌原纖維蛋白質及肌漿蛋白質有明顯的分解作用。另外，不同的Curdlan 及Alcalase 添加量對生鮮調理牛肉的剪切力、蒸煮損失均有顯著的影響( P＜0.05); 并且Curdlan、Alcalase 對生鮮調理牛肉感官品質有顯著的促進作用; 通過響應曲面試驗二次回歸法優(yōu)化生鮮調理牛肉工藝，得到工藝條件為Curdlan 添加量5.43mg/g，Alcalase 添加量4.29U/g，腌制時間73.4 h，以該工藝進行驗證實驗后得到產(chǎn)品剪切力為(0.960 ±0.006)kg，蒸煮損失為(19.96±0.36)%，感官評分為92.81±0.75，與理論值相比，相對誤差小于5%，該工藝準確可靠，可以用于生鮮調理牛肉的嫩化加工處理。

　　關鍵詞: 牛肉; 可得然膠; 堿性蛋白酶; 生鮮; 嫩化; 剪切力; 蒸煮損失

　　目前中國的牛肉銷售仍以冷凍儲藏銷售和市場開放式的熱鮮肉銷售為主。調理肉制品是以生鮮肉為主要原料，并加入添加劑、配料及香辛料等，經(jīng)簡單加工后，以包裝或散裝形式貯存、運輸、銷售，主要特點是可直接食用或經(jīng)簡單加工、處理就可食用。研究表明，經(jīng)過諸如香辛料、Nisin、大蒜素等腌制后，可以顯著提高牛肉的保鮮期，并對牛肉顏色有顯著的保護作用。

　　可得然膠(Curdlan) 又稱為凝膠多糖、卡德蘭，是由葡萄糖通過β-l，3-D-葡萄糖苷鍵形成的多糖類線性大分子，因其來源廣泛、使用方便等特性于2006年被衛(wèi)生部批準為食品添加劑新品種。研究表明，可得然膠可以在pH為3.0～9.5的水溶液中形成可逆的凝膠，通過其呈膠性能可以實現(xiàn)對面粉、肉類、肉糜類的改性。堿性蛋白酶( Alcalase)是一種專一性較弱的內切酶，其作用位點有多種: Ala、Leu、Val、Tyr、Phe、Trp，可用于肉類蛋白的深度酶解，并已在干腌肉制品中得到了廣泛的應用。雖然Curdlan及Alcalase在食品領域中已得到廣泛的應用，但是應用于牛肉加工以提高牛肉品質的研究還未見報道。

　　本研究擬通過不同濃度的Curdlan 及Alcalase 嫩化生鮮調理牛肉，并通過其蛋白質分解特性及質構特性優(yōu)化加工工藝，以期為生鮮牛肉的發(fā)展提供理論依據(jù)及技術支持。

　　牛肉: 根據(jù)GB/T 17238—2008從安徽翰森荷金來屠宰場采樣，隨機選取9條常規(guī)屠宰分割的牛背最長肌，冷卻排酸24h后0～4℃冷藏備用;

　　食鹽、料酒、香辛料等；

　　Alcalase2.4l: 酶活力＞200×104U/g;蛋白質分子量標準: 11～250 kDa；消化片(5.5g硫酸鉀和0.5g無水硫酸銅)；可得然膠。

　　速冷凍離心機: Allegra 64Ｒ型;自動凱氏定氮儀: KjeltecTM 2300型; 消化爐: KDN-04型；小型電泳垂直系統(tǒng): 165-8000型；

　　智能恒溫水浴鍋: ZKSY-600型；電子分析天平: AUY120型；紫外—可見分光光度計:UV-2450型。

　　1． 3． 1 工藝流程

　　T₁: 原料肉→前處理→Alcalase 與Curdlan 及香辛料等腌制→4℃儲藏→成品包裝處理

　　T₂: 原料肉→前處理→Alcalase 及香辛料等腌制→4℃儲藏→成品包裝處理

　　T₃: 原料肉→前處理→Curdlan 及香辛料等腌制→4℃儲藏→成品包裝處理

　　T₄: 原料肉→前處理→香辛料等腌制→4 ℃儲藏→成品包裝處理

　　前處理: 將牛肉清洗后瀝干水分，按照長寬厚切成10cm×3cm×1cm的長方體塊備用。

　　Alcalase 腌制: 根據(jù)試驗設計分別注射質量分數(shù)為0.002% Alcalase 酶溶液，通過不同體積注射，使肉塊中酶活力單位至試驗要求，注射完畢后按摩雞肉促進酶液均勻擴散。

　　Curdlan 腌制: 將Curdlan 配制成質量分數(shù)為10% 的可逆凝膠，在50℃水浴條件下，初步攪拌3 min后停止，繼續(xù)加熱7 min。取出后冰水冷卻，置于4℃冷藏備用。

　　香辛料添加質量分數(shù): 八角粉0.02%、花椒粉0.001%、小茴香粉0.01%、白芷0.002%、丁香0.002%、甘草0.01%。

　　1.3.2  Curdlan 協(xié)同Alcalase 對調理牛肉的影響

　　(1)Curdlan 協(xié)同Alcalase 對調理牛肉品質的影響:

　　Curdlan 與Alcalase 按照質量比為4.0mg /g、3U/g，分別按照T1、T2、T3、T4組嫩化生鮮調理牛肉，并分析其在4℃儲藏72h后的剪切力、蒸煮損失及感官品質。

　?。?）Curdlan 協(xié)同Alcalase 對調理牛肉蛋白質水解的影響: 分別將Curdlan 與Alcalase 按照表1 添加至各設計處理組中，4℃儲藏48h，通過SDS-PAGE 電泳分析其蛋白質變化結果，其中未處理作為對照組。

　　表1 不同處理組設計

　　1.3.3  生鮮調理牛肉嫩化工藝優(yōu)化

　　（1）腌制時間對嫩化效果的影響: 固定Alcalase 添加量為4U/g，Curdlan 添加量為5mg/g，并分析原料肉在4℃儲藏24，48，72，96，120h后的剪切力、蒸煮損失及感官品質。其中，對照組為無Alcalase 及Curdlan 添加。

　?。?） Curdlan 添加量對嫩化效果的影響: 固定Alcalase 添加量為4 U/g，分別用質量分數(shù)為0，2，4，6，8，10 mg /g的Curdlan 溶液嫩化原料肉，并分析其在4℃儲藏72h后的剪切力、蒸煮損失及感官品質。

　?。?） Alcalase 添加量對嫩化效果的影響: 固定Curdlan 添加量為5 ng /g，分別用0，1，2，3，4，5，6 U/g的Alcalase 酶解原料肉，并分析其在4℃儲藏72h后的剪切力、蒸煮損失及感官品質。

　?。?）響應曲面試驗設計: 采用軟件Design Expert 8.0.6( State-Ease，Minneapolis，MN，USA) 中的Box-Behnken 模式進行響應曲面試驗設計，以剪切力、蒸煮損失、感官評分為指標，Curdlan 添加、Alcalase 添加及腌制時間作為主要的考察因素( 自變量) 。

　?。?）蛋白組分提取。（2）SDS-PAGE 電泳方法。（3）蒸煮損失測定。（4）剪切力測定。（5）感官評定方法。

　　所有數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel 進行統(tǒng)計處理，用SAS 9.2進行ANOVA 分析，不同平均值之間利用LSD法進行差異顯著性檢驗。用Design Expert 8.0.6 建立響應曲面回歸方程，響應曲面試驗結果利用最小二乘法進行二次多項式回歸統(tǒng)計分析。

　　2.1.1  對牛肉品質的影響由圖1可知，與T4相比，添加Curdlan 處理后( T3) ，產(chǎn)品的剪切力呈上升趨勢( P＜0.05) ，而經(jīng)過Alcalase 酶解后牛肉的剪切力顯著降低( P＜0.05)( T2) ; 并且Curdlan 及Alcalase 協(xié)同處理后( T1) 產(chǎn)品的剪切力略微增加，但是與T2剪切力相比，差異不顯著( P＞0.05)。對于蒸煮損失，經(jīng)過Alcalase 處理后，產(chǎn)品的蒸煮損失呈顯著的升高趨勢( P＜0.05，而通過T3可以看出，一定的Curdlan可以降低牛肉的蒸煮損失，并且Curdlan 及Alcalase協(xié)同處理后，可以顯著降低產(chǎn)品的蒸煮損失(P＜0.05) 。原因主要是經(jīng)過Alcalase 處理后，牛肉中部分肌漿蛋白及肌原纖維蛋白逐漸分解，降低了產(chǎn)品的剪切力，但是由于酶促作用改變了牛肉中原有的保水性，因此，增加了產(chǎn)品的蒸煮損失; 另外，Curdlan 在牛肉中可以形成不可逆的凝膠，一定程度增加了產(chǎn)品的剪切力，達到保水的作用。另外，通過對產(chǎn)品感官評分可以看出，經(jīng)Alcalase 及Curdlan 處理后( T1) ，產(chǎn)品的感官評分顯著高于其余3組( P＜0.05) 。
 

　　
圖1 不同腌制條件對生鮮調理牛肉品質的影響

　　2.1.2   對蛋白質水解的影響  由圖2可知，與對照組相比( T4) ，Alcalase 對肌原纖維蛋白質有明顯的分解作用，主要表現(xiàn)為試驗組肌原纖維蛋白質在120～200kDa 左右的蛋白條帶變暗，70kDa及40～50 kDa 處的蛋白質條帶顏色加深( T1、T2)。并且，在T3中可以看出，Curdlan 雖然對肌肉中質構特性有重要作用，但是對于肌原纖維蛋白分解無明顯作用。對于肌漿蛋白質，T1、T2中大量大分子蛋白質逐漸分解，并且小分子逐漸累積; 主要表現(xiàn)為在試驗組中，85～200kDa的蛋白條帶逐漸變暗消失，而30～40kDa 及40～50kDa兩處的條帶顏色逐漸變深。但是在T3中并無明顯的蛋白質分解現(xiàn)象，因此可以看出，僅添加Curdlan 對肌漿蛋白的分解無促進作用。

　　綜合Curdlan 與Alcalase 對牛肉品質的影響結果可以看出，對牛肉蛋白質的存在形式有顯著分解作用的主要是Alcalase，而Curdlan 主要是影響牛肉中的質構特性。分析原因: ① Curdlan 本身具有良好的呈膠性能，其螺旋結構可以吸水溶脹，競爭更多水分的同時影響了其余鹽離子的活動及蛋白質溶液中原有的非特異結合作用、離子鍵和氫鍵;② Alcalase是一種專一性較弱的內切蛋白酶，可能對蛋白質長鏈中多個位點進行作用而產(chǎn)生小分子蛋白質、肽類等。綜上可以得出，Curdlan 與Alcalase 對牛肉蛋白質結構及組成有明顯的影響，可以用于生鮮調理牛肉的嫩化。

　　

圖2 生鮮調理牛肉蛋白質組分的SDS-PAGE 電泳圖譜

　　2.2.1  腌制時間對生鮮調理牛肉品質的影響  由圖3可知，隨著腌制時間的延長，產(chǎn)品的剪切力與蒸煮損失變化趨勢相似，均呈現(xiàn)在24～72 h時逐漸降低，顯著低于對照組剪切力與蒸煮損失( P＜0.05) ，并且對應的產(chǎn)品的感官評分逐漸增加，顯著高于對照組( P ＜0.05)；但是隨著腌制時間的繼續(xù)延長(72h后) ，產(chǎn)品的剪切力與蒸煮損失逐漸增加，對應的感官評分逐漸降低。

　　2.2.2  Curdlan 添加量對生鮮調理牛肉品質的影響  由圖4可知，隨著Curdlan 添加量的增加，產(chǎn)品的剪切力呈先降低后增加的趨勢( P＜0.05) 。由此可知Curdlan 對改善生鮮牛肉的嫩度有重要的作用; 但是，隨著Curdlan 添加量的繼續(xù)增加，導致凝膠能力增強，并且與水結合的能力也逐漸增加，影響了鹽離子的活動，從而導致產(chǎn)品剪切力逐漸增加，隨著Curdlan 添加量的增加，產(chǎn)品的蒸煮損失逐漸降低，可能是Curdlan 多糖分子能夠與水相互作用形成分子內氫鍵，從而達到降低蒸煮損失的作用。

　　2.2.3  Alcalase 添加量對生鮮調理牛肉品質的影響  由圖5可知，隨著Alcalase 添加量的增加，牛肉剪切力顯著降低，并且產(chǎn)品的感官評分先增加后降低，在酶添加量為4U/g時產(chǎn)品有較高的感官品質，并且該條件下產(chǎn)品的蒸煮損失顯著低于其余水平(P＜ 0.05) 。因此，適當?shù)腁lcalase 能夠達到嫩化生鮮調理牛肉的目的，但是過高的酶添加量會導致產(chǎn)品品質的降低。

　　

圖5 Alcalase 添加量對生鮮調理牛肉品質的影響

　　2.2.4  響應曲面試驗結果  根據(jù)單因素試驗結果確定試驗因素水平設計見表2。表3為不同腌制條件中生鮮調理牛肉品質變化結果。利用Design-Expert 8.0.6 軟件對表3試驗數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸分析，建立以剪切力( Y1) 、蒸煮損失( Y2) 、感官評分( Y3) 對3個響應因素的二次多項式的回歸方程:

　　Y1= 5.48－0.79X1－0.75X2－0.02X3+0.04X1X2+4.51× 10-4X1X3+2670X2X3+0.05X21+ 0.04X22+4.68×10-5 X23，   （1）

　　Y2=194.68－20.14X1－28.81X2－1.42X3－0.56X1X2+0.03X1X3+0.05X2X3+1.59X21+3.28X22+ 7.53×10-3 X23        （2）

　　Y3=-201.45+42.91X1+57.51X2+1.68X3－3.82X1X2－0.06X1X3－0.06X2X3－2.34X21－3.73X22－7.48×10-3X32。 （3）

　　為了驗證建立的回歸模型是否顯著，對模型進行方差分析，結果見表4。表4中結果表明，3個回歸模型的顯著性( F 檢驗) 檢驗結果極顯著( P＜0.01) 、失擬性檢驗結果均不顯著( P＞0.05) ，說明試驗中優(yōu)化的二次模型能夠擬合真實的試驗結果。另外，3個二次模型決定系數(shù)( Ｒ2 ) 與模型校正決定系數(shù)( Ｒ2Adj) 均大于0.9，并且模型信噪比均大于臨界值4。綜上結果，說明3個模型擬合效果良好，試驗誤差小，可信度高。因此試驗中模型可以用于生鮮調理牛肉工藝優(yōu)化。

　　
表2 試驗自變量因素編碼及水平

　　

　　
表4 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗

　　由表4可知，各二次項對結果均有顯著的影響；在交互項中可以得出，對于剪切力，Alcalase 添加量與Curdlan 添加量及腌制時間之間對產(chǎn)品剪切力均有顯著的交互作用；對于蒸煮損失，腌制時間與Alcalase 添加量及Curdlan 添加量之間有顯著的交互作用; 對于感官評分，Curdlan 添加量與腌制時間及Alcalase 添加量之間有顯著的交互作用，具體分析如下。

　　2.2.5  試驗因素交互作用分析

　　（1）不同條件對小塊牛肉剪切力的影響: 由圖6(a) 可知，在固定腌制時間為72h時，隨著Alcalase 添加量的增加，影響產(chǎn)品剪切力的Curdlan 添加量的臨界值( 最適添加量) 呈上升趨勢，并且該條件下產(chǎn)品的剪切力臨界值呈先降低后升高的趨勢。主要原因是隨著酶添加量的增加，部分蛋白質逐漸分解，牛肉中蛋白質水解指數(shù)及肌纖維小片化指數(shù)逐漸增加，從而降低了產(chǎn)品的剪切力。當固定Curdlan 添加量時，Alcalase 添加量與腌制時間對剪切力也存在交互作用，并且從圖6(b)中可以看出，在腌制時間為70～80h 時，剪切力存在臨界值；在該范圍內，隨著Alcalase 添加量的增加，該臨界值逐漸降低。由此可以看出，在生鮮牛肉調理過程中，不同的因素對肌肉環(huán)境有復雜的交互作用，通過對交互作用分析對優(yōu)化調理工藝有重要的作用。

　　（2）不同條件對小塊牛肉蒸煮損失的影響: 由圖7可知，在固定Curdlan 添加量為5.5mg/g時，隨著腌制時間的延長，不同Alcalase 添加量對蒸煮損失影響的臨界值呈先降低后升高的趨勢，在腌制72h左右出現(xiàn)臨界值；主要是不同Alcalase 條件下，隨著腌制時間的延長，對肌肉蛋白質作用結果也不盡相同，從而影響了產(chǎn)品的保水性及小分子的溶出。另外，不同Curdlan 添加量與腌制時間對蒸煮損失的交互作用影響與其相似，也呈現(xiàn)隨腌制時間的延長，不同Curdlan 添加量對蒸煮損失影響的臨界值呈先降低后升高的趨勢。主要是因為在肌肉中Curdlan 形成穩(wěn)定凝膠后，對肌肉蛋白質分子形成包埋作用，造成蛋白質的疏水性增強，從而影響了產(chǎn)品的蒸煮得率。

　?。?）不同條件對小塊牛肉感官品質的影響: 由圖8可知Curdlan 添加量是影響產(chǎn)品感官品質的最主要的指標，在不同條件下，隨著Curdlan 添加量的增加，產(chǎn)品的感官品質呈先增高后降低的趨勢; 固定腌制時間為72h 時，隨著Alcalase添加量的增加，影響產(chǎn)品感官品質的Curdlan 添加量的臨界值呈上升趨勢，該結果與剪切力分析結果中趨勢一致，該條件中產(chǎn)品感官評分的臨界值呈先增加后降低的趨勢。另外，在固定Alcalase 添加量為4U/g時，由于Curdlan 在肌肉中的呈膠能力不斷改變，導致隨著腌制時間的延長，產(chǎn)品的感官品質呈先升高后降低的趨勢。

　　2.2.6  工藝優(yōu)化  本次試驗以感官評分最大值、剪切力及蒸煮損失最小值為目標值，利用Design-Expert 軟件自帶的結果優(yōu)化程序對生鮮調理牛肉工藝進行優(yōu)化，得到優(yōu)化后的工藝條件為Curdlan 添加量5.43 mg /g，Alcalase 添加量4.29 U/g，腌制時間73.4h，該條件下的預測值為剪切力1.0 kg，蒸煮損失19.96%，感官評分92.81，以該工藝進行驗證實驗后得到產(chǎn)品剪切力為( 0.960±0.006) kg，蒸煮損失為( 19.96±0.36) %，感官評分為92.81±0.75(n=3)。相對誤差小于5%，因此該工藝準確可靠，可以用于生鮮調理牛肉的嫩化加工處理。

　　本研究結果說明，Curdlan 與Alcalase 對生鮮調理牛肉品質有明顯的促進作用，Alcalase 對肌原纖維蛋白質及肌漿蛋白質有明顯的分解作用，而Curdlan 對肌漿蛋白及肌原纖維蛋白質均無明顯的分解作用。Curdlan 及Alcalase不同的添加量對生鮮調理牛肉的剪切力、蒸煮損失均有顯著的影響(P＜0.05)；并且Curdlan、Alcalase 對生鮮調理牛肉感官品質有顯著的促進作用。本研究優(yōu)化的工藝準確可靠，可以用于生鮮調理牛肉的嫩化加工處理。