摘要：為研究超臨界CO2處理對鮮牛肉滅菌效果及食用品質(zhì)的影響，本實驗考察了壓強、溫度和時間等因素對鮮牛肉滅菌效果影響，采用正交法優(yōu)化滅菌條件，并比較滅菌處理前后鮮牛肉食用品質(zhì)指標。結(jié)果表明，在滅菌溫度50℃、滅菌壓強14MPa、滅菌時間10min時鮮牛肉滅菌效果最優(yōu)，滅菌率可達99%。此時鮮牛肉pH、肌纖維蛋白含量和硬度等指標輕微下降但差異不顯著，肌漿蛋白含量顯著下降（P＜0.05）肉色變化顯著，紅度值a*較處理前低，而黃度值b*和量度值 L*均較處理前高（P＜0.05）蒸煮損失和剪切力均較處理前顯著降低（P＜0.05）。因此，超臨界CO2處理對鮮牛肉滅菌效果顯著，有利于提高牛肉的食用品質(zhì)。

　　關(guān)鍵詞：超臨界 CO2，鮮牛肉，滅菌，品質(zhì)，正交實驗

　　超臨界CO2（SC--CO2）溫度＞31.1℃、壓強＞7.38MPa)是一種非水相溶劑，無毒無味、可循環(huán)利用，能夠溶解細胞膜中各組成成分。超臨界CO2能夠殺死食品中許多微生物并使部分酶失活，且能較好地保持食品的營養(yǎng)品質(zhì)。陳宇等認為，超臨界CO2殺菌機理在于卸壓時CO2急速膨脹導致細胞破裂，而Garcia等則認為CO2引起微生物新陳代謝紊亂才是主要原因。

　　目前，國外開展超臨界殺菌技術(shù)已有多年研究，超臨界CO2裝置和應用研究在一些發(fā)達國家如美國、日本、意大利等均有報道。Sirisee等研究發(fā)現(xiàn)，絞細牛肉經(jīng)超臨界CO2( 31.03 MPa，42.5℃) 處理后，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌落下降了一個對數(shù)期。研究發(fā)現(xiàn)，絞細牛肉經(jīng)超臨界CO2處理后顏色發(fā)暗，這可能是高濃度CO2與肌紅蛋白作用而形成高鐵肌紅蛋白，以致使肉色變暗，尤其是在少量氧氣存在的情況下，這種情況更易發(fā)生。Hong等研究發(fā)現(xiàn)，壓力范圍50～200MPa，處理時間0～60min，肉的亮度值和紅度值明顯增加。日本研究人員發(fā)現(xiàn)經(jīng)過高壓處理牛肉肉質(zhì)鮮嫩，且富有彈性。還有實驗表明，高壓能導致肌內(nèi)周膜與肌外周膜剝離及肌原纖維間隙增大，促進了肌肉嫩化。在國內(nèi)，也有學者在不斷探索超臨界CO2滅菌模型及研究進展。近年來，許多研究者也報道了在固態(tài)食品方面的超臨界CO2滅菌。在肉制品方面，孫源源研究了超臨界CO2對肉餡中細菌的殺菌效果并應用兩種模型進行了分析，但關(guān)于超臨界CO2對鮮牛肉滅菌效果及蛋白營養(yǎng)和質(zhì)構(gòu)特性影響的研究報道很少。

　　本實驗以鮮牛肉為研究對象，對牛肉中的嗜中溫需氧細菌、乳酸菌、嗜冷細菌的滅菌效果進行了研究。研究不同殺菌溫度、壓強、時間下殺菌效果，采用正交實驗對滅菌條件進行優(yōu)化，測定滅菌處理前后牛肉pH、肉色、剪切力、蛋白含量、蒸煮損失和質(zhì)構(gòu)特性等理化指標，旨在研究超臨界CO2殺菌技術(shù)對鮮牛肉品質(zhì)的影響。

　　1  材料與方法

　　鮮牛肉外脊3500g購買于甘肅張掖市萬禾草畜產(chǎn)業(yè)科技開發(fā)有限責任公司，取1500g于4℃冷藏，剩下2000g牛肉切成25cm×25cm×80cm肉丁，置于4℃冷藏；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基;K2HPO4、KH2PO4、磷酸緩沖液、所用培養(yǎng)基及溶液所需試劑均為分析純。

　　HA221－05－01超臨界萃取設備；CP214型電子天平；SYQ－DSX－280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器；SW－CJ－1FD型超凈工作臺；LHS－150SC 恒溫恒濕培養(yǎng)箱；便攜式pH型Ttesto205；CR－10色差計；UV756CRT紫外可見分光光度計；TA.XTExpress 質(zhì)構(gòu)儀；BSA224S電子天平。

　　1.2  實驗方法

　　1.2.1  超臨界CO2殺菌過程  將超臨界設備處理釜預熱到設定溫度40℃，然后將處理好肉塊置于處理釜中( 釜提前經(jīng)體積分數(shù)75%酒精消毒) 預熱。首先打開進氣閥和放氣閥，確?？諝馀懦缓箨P(guān)閉放氣閥，經(jīng)過5～10min的升壓過程達到設定壓力20MPa，然后樣品在設定條件進行處理，樣品處理結(jié)束后，關(guān)閉進氣閥，打開放氣閥，經(jīng)過約15～20min卸壓，將處理釜取出移入超凈工作臺。

　　1.2.2  菌懸液制備  用無菌剪刀取檢樣深層肌肉25g，放入滅菌研缽內(nèi)剪碎、研磨后加入225mL磷酸鹽緩沖液混勻稀釋。取1mL稀釋液加入10mL磷酸鹽緩沖液，即1:100稀釋液。

　　1.2.3 微生物培養(yǎng)和菌落計數(shù)  將滅菌后的和滅菌前牛肉按上述方法制備的菌懸液，每個濃度取0.1mL涂平板，每個濃度涂兩個平板，然后在表1中培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，取30～300個菌落的培養(yǎng)皿，通過平板菌落計數(shù)嗜中溫需氧細菌、乳酸菌、嗜冷細菌。

　　表1  微生物的培養(yǎng)條件

　　菌落總數(shù)參照GB 4789.2－2010《食品衛(wèi)生微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》 進行測定,結(jié)果以對數(shù)表示。

　　1.2.4  實驗設計

　　1.2.4.1  單因素實驗  設定滅菌溫度45℃、滅菌時間15min，滅菌壓強分別8、10、12、14、16MPa；設定滅菌溫度45℃、滅菌壓強12MPa，滅菌時間分別為5、10、15、20、25 min；設定滅菌時間15min、滅菌壓強12MPa，滅菌溫度為35、40、45、50、55℃；然后對牛肉進行滅菌。同時做空白對照組，按上述方法檢測菌落總數(shù)，實驗結(jié)果為3次平均值。

　　1.2.4.2  正交實驗  根據(jù)單因素實驗確定因素和水平，選取滅菌壓強、滅菌溫度和滅菌時間為因素，每個因素選取3個水平。采用 L9( 33) 正交實驗設計。正交實驗設計因素和水平見表2。

　　表2  L9( 33) 超臨界 CO2滅菌處理鮮牛肉正交實驗的因素和水平表

　　1.2.5  測定指標

　　1.2.5.1   pH 測定  用干凈濾紙吸干肉樣表面殘留水分，用Testo205型便攜式pH計隨機對肉樣三個不同部位的新鮮切口進行pH測定，實驗結(jié)果取平均值。

　　1.2.5.2  肉色測定  從肉樣上垂直于肌纖維方向切取0.5cm厚的切片，用CＲ－10型色差儀測定樣品肉色，讀取亮度( L*)、紅色度( a*) 和黃色度( b*)，每個肉樣測定3次，結(jié)果以平均值表示。

　　1.2.5.3  剪切力測定  取形狀規(guī)則(3cm×3cm×2cm) 的肉樣，水浴至中心溫度75℃后取出肉塊，冷卻至室溫，順著肌纖維方向用直徑1.27cm的取樣器鉆取3個肉柱，用壓力儀測定每個肉柱的剪切力值，求其平均數(shù)。

　　1.2.5.4  蒸煮損失測定  按照蔡淑偉相應的測定方法進行，取肉樣剔除筋膜稱質(zhì)量m1，然后放入蒸煮袋并密封，恒溫水浴，待肉樣中心溫度達70℃并保持20min，取出冷卻至室溫，稱質(zhì)量m2，按式計算蒸煮損失率。

　　蒸煮損失率(%)=(m1－m2)/m1×100

　　式中: m2指蒸煮后的肉樣質(zhì)量，g；m1指蒸煮前的肉樣質(zhì)量，g。

　　1.2.5.5  蛋白質(zhì)含量測定  參照Joe等的方法測定蛋白質(zhì)溶解性。肌漿蛋白質(zhì)溶解度: 1g 肉樣加10mL冰冷的0.025mol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.2)，冰浴條件下10000r/min勻漿20s，勻漿3次，4℃搖動抽提12h。1500r/min 離心20min，上清液用雙縮脲法測定蛋白含量?？偟鞍踪|(zhì)溶解性: 1g肉樣加20mL冰冷的1.1mol/L碘化鉀在0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.2)，冰浴條件下10000r/min勻漿20s3次，4℃搖動抽提12h。1500r/min 離心20min，上清用雙縮脲法測定。肌纖維蛋白質(zhì)溶解性(mg/g)=總蛋白質(zhì)溶解性(mg/g)－肌漿蛋白質(zhì)溶解性(mg /g) 。

　　1.2.5.6  質(zhì)構(gòu)特性分析(TPA)  參考Stejskal V等的方法并稍作修改。樣品在恒溫水浴鍋中加熱至中心溫度達70℃并維持30min后自然冷卻至室溫，沿肌纖維方向?qū)悠沸拚麨楦叨?cm、橫截面 1cm×1cm試樣3份，實驗結(jié)果以平均值表示。

　　測試條件: 采用“二次壓縮(TPA)”模式，探頭型號：P/50；下行速度:4 mm/s；測試速度: 6mm/s；返回速度: 6mm/s；下行距離：60%樣品厚度；兩次壓縮間隔時間：5s；觸發(fā)力：5g。本研究中選取硬度、彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性4個參數(shù)作為分析指標。

　　1.2.6  數(shù)據(jù)處理  采用Microsoft Office Excel 2007 及IBM SPSS Statistics 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

　　2  結(jié)果與討論

　　2.1.1  處理壓強對鮮牛肉滅菌效果影響 一般來說，壓強越高，殺菌效果越好，因為較高壓強能提高CO2滲透性，也能增強對細胞的物理性傷害。由圖1可以看出，隨著壓強增大，鮮牛肉中細菌殺滅對數(shù)值Y=－logS逐漸增大，即殘活率逐漸減小。當壓強達到12MPa以上時，鮮牛肉中細菌Y值達到2.58，且增長緩慢，表明滅菌壓強在大于12MPa可以有效地殺滅鮮牛肉中細菌。

　　2.1.2  處理時間對鮮牛肉滅菌效果影響  由圖2可以看出，隨著處理時間延長，Y值增長緩慢，當處理時間達到15min上時，鮮牛肉中細菌Y值達到2.55，接近峰值，可初步確定鮮牛肉處理時間為15min左右。

　　2.1.3  處理溫度對鮮牛肉滅菌效果影響  一般來說，其他條件相同時，溫度越高殺菌效果越好，高溫可能增加CO2的擴散性，能增加細胞膜的流動性，從而提高殺菌率。由圖3可見，溫度較低時，殺滅對數(shù)值較小但增速較快，在50℃達到最大；繼續(xù)升高溫度，殺滅對數(shù)值的變化趨于緩和。

　　在單因素實驗基礎上，以殺滅對數(shù)值Y =－logS為指標，對鮮牛肉中嗜中溫細菌( Y1 )、乳酸菌( Y2)、嗜冷菌(Y3) 的滅菌效果進行分析，進一步確定最優(yōu)滅菌組合。正交實驗結(jié)果如表3所示。

　　由表4極差分析結(jié)果可知，各因素對嗜中溫細菌滅菌效果影響程度為C＞B＞A，即壓強＞溫度＞時間；各因素對乳酸菌滅菌效果影響程度為 C＞B＞A，即壓強＞溫度＞時間；各因素對嗜冷菌滅菌效果影響程度為B＞C＞A，溫度＞壓強＞時間。由此可知，壓強和溫度是影響滅菌效果的主要因素，初步確定滅菌條件 A1B3C3，但考慮到實際操作成本和肉品質(zhì)影響，因此對各因素進行顯著性方差分析見表5，來進一步確定最優(yōu)滅菌條件。

　　注: 顯著水平:ns=不顯著，* p＜0.05，**p＜0.01，表6～表8同。

　　由表5可看出，因素 A、B、C對嗜中溫細菌滅菌效果均不顯著；但對于乳酸菌，因素C對其滅菌效果顯著；而對嗜冷細菌，因素B和C對其滅菌效果均顯著。由此可知，溫度和壓強是影響滅菌效果的主要因素，為節(jié)約成本，在滅菌時間對結(jié)果影響不顯著時,降低時間也可達到相同滅菌目的。因此，本實驗最終確定出鮮牛肉最優(yōu)滅菌條件為A1B3C3：溫度為50℃、壓強為14MPa、時間為10min。

　　2.3  驗證實驗

　　在最優(yōu)滅菌條件: 溫度50℃、壓強14MPa、時間10min下，對鮮牛肉進行滅菌處理，總細菌殺滅對數(shù)值達到最大為3.42個數(shù)量級，即滅菌率可達99%，此驗證實驗說明，該條件下對細菌滅菌效果較好。

　　2.4  超臨界CO2滅菌技術(shù)對鮮牛肉品質(zhì)影響研究

　　表6結(jié)果顯示，鮮牛肉pH滅菌處理后差異不顯著，但有降低趨勢，可能是由于鮮牛肉在超臨界CO2處理過程中，CO2在高壓條件下與牛肉中的水分反應，產(chǎn)生了少量 H2CO3，導致鮮牛肉pH在超臨界處理后略微降低，但這不影響鮮牛肉整體品質(zhì)。鮮牛肉紅度值a*在滅菌處理前后差異顯著，處理后鮮牛肉紅度值a*明顯低于處理前，這可能是由于肌漿中肌紅蛋白和血紅蛋白在壓力作用下逐漸變性而失去所固有紅色，導致肌肉中紅色逐漸變淡、發(fā)灰色，最后呈類似煮肉灰白色的緣故。鮮牛肉黃度值b*和亮度值L*均在滅菌處理前后差異極顯著，滅菌前黃度值b*明顯小于滅菌后，而處理之亮度值L*顯著增加，該實驗結(jié)果與Choi等的研究結(jié)果一致。產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能是由于肌紅蛋白中球蛋白變性或者亞鐵血紅素被取代或失去所造成的的緣故，但有關(guān)理論還需進一步研究。鮮牛肉的嫩度值在滅菌處理后差異極顯著，其嫩度值顯著升高。這是由于高壓處理對肌肉具有一定嫩化作用。高壓處理后肉質(zhì)變嫩表明在加壓處理過程中肌肉的肌節(jié)結(jié)構(gòu)受損，肌纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。鮮牛肉蒸煮損失在滅菌處理后差異顯著，處理后的鮮牛肉蒸煮損失明顯低于處理前，這是由于鮮牛肉在超臨界CO2處理過程中水分流出而導致的緣故。

　　注: 最優(yōu)滅菌條件: 溫度50℃、壓強14MPa、時間10min下進行; 表7、表8同。

　　表7分析結(jié)果顯示，鮮牛肉的肌纖維蛋白含量在滅菌處理前后差異不顯著，但是肌漿蛋白含量和總蛋白含量變化顯著，均有不同程度的降低?？赡苁怯捎诟邏涸斐杉{蛋白變性使其可溶性降低或是高壓導致肌原纖維蛋白質(zhì)凝聚降低了肌質(zhì)蛋白的吸光率。

　　表8表明，鮮牛肉的硬度在滅菌處理后差異不顯著，有降低趨勢，滅菌處理后的鮮牛肉彈性、咀嚼性、內(nèi)聚性差異不顯著但有升高趨勢。另外，鮮牛肉的粘性值在滅菌處理前后基本不變，這說明超臨界CO2滅菌處理不影響鮮牛肉的質(zhì)構(gòu)特性。

　　3  結(jié)論

　　影響超臨界CO2對鮮牛肉滅菌效果的主要因素是壓強和溫度。當滅菌溫度為50℃、滅菌壓強為14MPa、處理時間為10min時滅菌效果最優(yōu)，滅菌率達99%；鮮牛肉在超臨界CO2處理前后的質(zhì)構(gòu)變化不顯著，肌纖維蛋白含量無顯著變化，肌漿蛋白含量顯著下降，從而影響肉色( 黃度值和亮度值)變化；超臨界CO2滅菌技術(shù)處理后的鮮牛肉pH無顯著變化，嫩度顯著提高，而蒸煮損失顯著下降，一定程度上改善牛肉食用品質(zhì)。